※ 本文為 MindOcean 轉寄自 ptt.cc 更新時間: 2020-02-19 16:04:35
看板 nCoV2019
作者 標題 [討論] 連猴子也懂得PCR原理(?)
時間 Tue Feb 18 00:24:12 2020
看到版上有不少人在問,想想也該發篇大家都懂通俗點的科普文章比較好
PCR簡單來說就是個複製 DNA的技術
假如DNA序列是本超厚的教科書(模板),而考試內容是考這本書的內容
你想要把要考的重點抄下來 (DNA聚合酶)
但你他媽的根本不知道要抄三小,沒人跟你說要從哪開始抄
所以需要一個導引,告訴你從哪開始
這個導引就是引子 (Primer),它告訴你從哪開始抄
知道後,你就拿著原子筆開始抄下來,而墨水就是核苷酸 (ATCG)
那一個複製DNA的技術怎麼用來檢驗呢?
假如今天你要抄寫朱自清的背影(檢驗目標,像是某種病毒)
你的引子可能是開頭
"我與父親不相見已二年餘了，我最不能忘記的是他的背影"
所以理論上你是要抄下有這段話的文章
但今天你拿到的書(檢體)是"連猴子都懂得神經解剖學"
你拿了這段引子對照了整本書,你他媽的還是不知道要抄啥
所以沒抄寫出東西(沒擴增),所以你知道這本書沒有你要的東西
大GUY4醬
不過這是複製 DNA,如果是要檢測 RNA,像是這次 SARS-Cov 2是RNA病毒
就必須要先逆轉錄 (Reverse transcription, RT)
把 RNA轉成 cDNA,你的 DNA聚合酶才懂
當然也是有能直接擴增 RNA的檢測技術像是 NASBA, TMA
不過就不說惹
有想問的我再補充
推文問到怎麼知道有沒有擴增,這邊就講一下 Real-time PCR
原理跟PCR一樣,不過多了點東西
以常用的 TaqMan probe為例,這是一種探針
探針跟引子很像,是一小段序列 (寡核苷酸),可以互補結合在 Primer之間的模板序列
不過這個探針兩端各加了兩種東西
(1) 螢光基團 (Fluorophore)
(2) 淬滅基團 (Quencher)
一開始時, Quencher會藉由 FRET(一種能量轉移形式)
抑制 Fluorophore發出螢光
但當 DNA聚合酶在複製延長時
會藉由 5'-3' Exonuclease活性,把擋在路中間的探針給分解掉
當分解掉後, Fluorophore和 Quencher之間的距離拉大分開了
此時就能順利激發出螢光,並能被偵測到
當分解掉後, Fluorophore和 Quencher之間的距離拉大分開了
此時就能順利激發出螢光,並能被偵測到
就能知道有擴增出東西來
https://imgur.com/nsZQxHH
![[圖]](https://i.imgur.com/nsZQxHH.png)
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 61.230.160.66 (臺灣)
※ 文章代碼(AID): #1UIhukSx (nCoV2019)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/nCoV2019/M.1581956654.A.73B.html
推 : 想請問是怎麼判斷有沒有擴增的呢？謝謝1F 39.10.62.74 台灣 02/18 00:28
推 : 跑電泳2F 123.194.133.52 台灣 02/18 00:30
→ : 話說我google之後看不懂real time的差別3F 39.10.62.74 台灣 02/18 00:32
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:55:04推 : 怎麼判斷擴增呢？電泳可，real time4F 203.204.128.45 台灣 02/18 00:34
→ : PCR可以邊做邊看有沒有擴增
→ : real time RT-PCR就是目前的做法
→ : real time Reverse Transcription P
→ : PCR
→ : PCR可以邊做邊看有沒有擴增
→ : real time RT-PCR就是目前的做法
→ : real time Reverse Transcription P
→ : PCR
推 : 感謝!!9F 111.71.49.61 台灣 02/18 00:36
推 : real time就是你在做反應的時候就可以知10F 114.34.124.132 台灣 02/18 00:38
→ : 道他有沒有在擴增了 所以叫即時的 一般p
→ : cr你要反應完跑電泳才知道
→ : 道他有沒有在擴增了 所以叫即時的 一般p
→ : cr你要反應完跑電泳才知道
→ : 原來差在這裡，這樣講我就懂了13F 111.71.49.61 台灣 02/18 00:39
推 : real time 就是有一個螢光的dye 當它bind14F 114.44.153.209 台灣 02/18 00:40
→ : 到雙股DNA時訊號會放大。這樣的話你就可
→ : 以"real time” monitor PCR的過程。
→ : 到雙股DNA時訊號會放大。這樣的話你就可
→ : 以"real time” monitor PCR的過程。
推 : 樓上晶晶體(X XDD17F 203.204.128.45 台灣 02/18 00:41
推 : 生物出國才開始學很多中文不知道怎麼說18F 114.44.153.209 台灣 02/18 00:42
→ : sorry 囧
→ : sorry 囧
→ : 正常啦 跟教授討論也是中文+英文20F 1.169.198.15 台灣 02/18 00:44
推 : 生科不可避免的晶晶體21F 223.141.29.247 台灣 02/18 00:48
推 : real time 簡單說就是在複製DNA的22F 101.136.175.129 台灣 02/18 00:49
→ : 時候，成功複製出來的DNA會有螢光
→ : ，所以如果檢體有病毒的核酸，隨著
→ : 複製的循環越來越多次，反應液就會
→ : 越來越亮。機器可以偵測亮度的變化
→ : ，另外，如果循環個幾次就偵測到訊
→ : 號，那就可以間接推論原本的病毒濃
→ : 度比較高；反之循環到快三十次才偵
→ : 測到亮光，那就是病毒含量比較低
→ : 以上
→ : 時候，成功複製出來的DNA會有螢光
→ : ，所以如果檢體有病毒的核酸，隨著
→ : 複製的循環越來越多次，反應液就會
→ : 越來越亮。機器可以偵測亮度的變化
→ : ，另外，如果循環個幾次就偵測到訊
→ : 號，那就可以間接推論原本的病毒濃
→ : 度比較高；反之循環到快三十次才偵
→ : 測到亮光，那就是病毒含量比較低
→ : 以上
推 : 感謝樓上與每位回覆的專家32F 111.71.49.61 台灣 02/18 00:50
→ : 其實我google很久但沒基礎實在看不懂...
→ : 其實我google很久但沒基礎實在看不懂...
→ : 希望有幫助XD34F 101.136.175.129 台灣 02/18 00:51
→ : 有問題可以再問
→ : 有問題可以再問
![[圖]](https://i.imgur.com/ZwQWlQLh.png)
推 : CDC 是重複 45 cycle 檢測方法有公布37F 1.169.198.15 台灣 02/18 00:54
→ : 這個表就是所謂的引子(Primer)嗎？38F 111.71.49.61 台灣 02/18 00:54
→ : 雖然寫的蠻簡單的就是了 XD39F 1.169.198.15 台灣 02/18 00:55
對,沒錯~那一些 Sequence就是 Primer※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:56:55
→ : 謝謝原PO的回答!!41F 111.71.49.61 台灣 02/18 00:57
歐對,你貼的那張圖中,有些 Sequence頭尾寫的 FAM和 BBQ就是 Probe的 Fluorophore及 Quencher
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 00:59:57
推 : 正想請教說為什麼會跑出ATCG以外的東西42F 111.71.49.61 台灣 02/18 01:00
推 : 有些非 ATCG 是 degenerate primer43F 111.82.239.170 台灣 02/18 01:04
推 : 你看最後是F跟R的就是用SYBR的 primer 如44F 114.44.153.209 台灣 02/18 01:04
→ : 果是P的就是R大內文裡面提到的probe
→ : 果是P的就是R大內文裡面提到的probe
推 : 這篇獲益良多，謝謝大家回答46F 111.71.49.61 台灣 02/18 01:05
推 : 另外推R大的比喻47F 114.44.153.209 台灣 02/18 01:07
推 : 其實依照目前的檢測方法就不要太期待準48F 223.137.252.29 台灣 02/18 01:19
→ : 確度，病毒的RNA序列如果出現變化，現在
→ : 用的primer就可能會沒效。在加上從病人
→ : 檢體這樣的複雜的樣品要萃取RNA然後還要
→ : 用RT轉，過程中很多地方可能會出錯。所
→ : 以我覺得現在很多人一直吹，其實意義不
→ : 大。反而用抗體來檢驗，可能藉由蛋白質
→ : 的功能保留性來維持較久的準確度，例如
→ : 常提到病毒的Spike蛋白質因為要去抓人類
→ : 細胞的ACE-2蛋白質才能感染，所以那段關
→ : 鍵的蛋白質序列，其變化理論上不會太大
→ : 。
→ : 確度，病毒的RNA序列如果出現變化，現在
→ : 用的primer就可能會沒效。在加上從病人
→ : 檢體這樣的複雜的樣品要萃取RNA然後還要
→ : 用RT轉，過程中很多地方可能會出錯。所
→ : 以我覺得現在很多人一直吹，其實意義不
→ : 大。反而用抗體來檢驗，可能藉由蛋白質
→ : 的功能保留性來維持較久的準確度，例如
→ : 常提到病毒的Spike蛋白質因為要去抓人類
→ : 細胞的ACE-2蛋白質才能感染，所以那段關
→ : 鍵的蛋白質序列，其變化理論上不會太大
→ : 。
※ 編輯: Reflection11 (61.230.160.66 臺灣), 02/18/2020 01:24:42
推 : 我是猴子 我看懂了 讚61F 118.167.70.60 台灣 02/18 01:26
→ : PCR 之歌 以前當 TA 都會放給醫學系大62F 1.169.198.15 台灣 02/18 01:30
→ : 一還大二的聽 XDD
推 : 要用抗體抓 抗體專一性很重要 不好的
→ : 可能抓出一堆雜 band 那也有得搞了 各
→ : 有優缺啦
→ : 一還大二的聽 XDD
推 : 要用抗體抓 抗體專一性很重要 不好的
→ : 可能抓出一堆雜 band 那也有得搞了 各
→ : 有優缺啦
推 : 現在的問題是連美國CDC都還沒來得及去驗67F 223.137.252.29 台灣 02/18 02:03
→ : 證這個方法的準確性。
推 : https://s.yam.com/6aGbR
→ : 證這個方法的準確性。
推 : https://s.yam.com/6aGbR
US coronavirus: Some test kits shipped to states are flawed, CDC says - CNN
![[圖]]()
Some of the coronavirus test kits shipped to labs across the country are not working as they should, the US Centers for Disease Control and Prevention ...
![[圖]](https://cdn.cnn.com/cnnnext/dam/assets/200205145513-us-centers-for-disease-control-and-prevention-coronavirus-test-kit-super-tease.jpg)
推 : 你這篇害我回到大學的痛苦時光70F 114.136.179.183 台灣 02/18 02:47
推 : ㄎㄎ的日常71F 111.71.127.201 台灣 02/18 02:59
推 : 推比喻淺顯易懂XD72F 114.24.172.153 台灣 02/18 03:04
推 : 生科推73F 118.161.97.83 台灣 02/18 03:26
推 : 對不起我們都只用sybrGreen74F 128.146.189.109 美國 02/18 03:42
→ : Taqman法實在太高大尚~
→ : Taqman法實在太高大尚~
推 : PCR之歌經典 XD76F 123.194.172.116 台灣 02/18 04:20
推 : 幫推77F 111.243.186.152 台灣 02/18 04:20
→ : 上面說抗體抓出雜band，PCR也有一樣的問78F 123.194.172.116 台灣 02/18 05:01
→ : 題，而且就算primer設計在專一序列，
→ : anealing溫度沒設定好一樣會有偽陽性
→ : 而且PCR的偽陽性應該比免疫偵測高，畢竟
→ : 是放大再放大，做錯了一樣放大
→ : 不過偽陽性是可以接受的，比起錯放，寧
→ : 可有偽陽性
→ : 免疫偵測法的問題主要不在專一性，而是
→ : 它的偵測極限終究比不上PCR
→ : 題，而且就算primer設計在專一序列，
→ : anealing溫度沒設定好一樣會有偽陽性
→ : 而且PCR的偽陽性應該比免疫偵測高，畢竟
→ : 是放大再放大，做錯了一樣放大
→ : 不過偽陽性是可以接受的，比起錯放，寧
→ : 可有偽陽性
→ : 免疫偵測法的問題主要不在專一性，而是
→ : 它的偵測極限終究比不上PCR
推 : 蛋白質專一性結合的問題很大呀，有做過We87F 114.136.93.184 台灣 02/18 05:41
→ : stern blotting就知道了
推 : PCR的準確率比較高，尤其病原體的基因和
→ : 人的差異這麼大，primer的設計簡單又快速
→ : stern blotting就知道了
推 : PCR的準確率比較高，尤其病原體的基因和
→ : 人的差異這麼大，primer的設計簡單又快速
推 : 講得不錯 推91F 220.136.12.173 台灣 02/18 07:31
推 : 先推92F 220.142.30.163 台灣 02/18 07:38
推 : 講的比老師說的還要聽得懂..推推93F 180.204.140.228 台灣 02/18 07:41
推 : 推94F 114.136.174.191 台灣 02/18 08:57
→ : rtpcrq的偽陽性比較低啦 因為還要taqmam95F 223.136.87.141 台灣 02/18 09:34
→ : probe接的上去
→ : 要更保險就產物拿去定序
→ : probe接的上去
→ : 要更保險就產物拿去定序
推 : Western blot 會很髒 麻煩98F 140.109.113.176 台灣 02/18 09:39
※ Reflection11:轉錄至看板 Gossiping 02/18 17:36
推 : 我好懷念PCR之歌XDDD99F 42.77.255.95 台灣 02/18 20:08
→ : qPCR準確性我覺得真的比ELISA高，且需要
→ : 的時間基本上也比較少，只要有好的primer
→ : +probe就很好用
→ : qPCR準確性我覺得真的比ELISA高，且需要
→ : 的時間基本上也比較少，只要有好的primer
→ : +probe就很好用
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